۳-۴-۳- آغازگرهای اختصاصی مورد استفاده جهت تکثیر ژنوم جدایه ایرانی ویروس بیبذری گوجه فرنگی
به منظور تکثیر قطعات RNA-1 , RNA-2 و RNA-3 جدایه ایرانی TAV مجزا شده از گیاه اطلسی و تکثیر ژن پروتئین پوششی جدایه مجزا شده از گیاه داوودی از آغازگرهای مختلفی که با بهره گرفتن از نرم افزار Fast-PCR طراحی شده بودند، استفاده گردید. در جداول۳-۵، ۳-۶ و ۳-۷ اسامی آغازگرها به همراه توالی نوکلئوتیدی و موقعیت ژنومی آنها بیان شده است.
۳-۴-۴- الکتروفورزافقی
مقدار۵/۰گرم آگارز در ۵۰ میلی لیتر بافر ^[۷۴]TBE حرارت داده شد تا کاملاً شفاف گردد. بعد از خنک شدن محلول، مقدار۵۰ میکرو لیتر اتیدیوم بروماید (با غلظتμg/ml50) به آن اضافه و بعد از قرار دادن شانه و فضا دهنده ها در داخل تانک الکتروفورز افقی مدل(Consort N. V., UK) H1Set، محلول به آرامی داخل تانک ریخته شد. پس ازبستن ژل آگارز، ۵۰ میلی لیتر از بافر TBE روی آن ریخته شد به طوری که کاملا روی ژل پوشانده شود. سپس شانه و فضا دهنده ها به آرامی برداشته شدند. همچنین جهت آماده سازی نمونه ها، از هر نمونه به میزان ۵ میکرولیتر برداشته و با ۲ میکرولیتر از بافر۶x loading dye مخلوط ومطابق با نقشه داخل چاهک مورد نظر اضافه شد. علاوه بر این یک چاهک به نشانگر مولکولی (Gene Ruler™۱Kb DNA Ladder, Fermentase) اختصاص داده شد. نشانگر مذکور نیز قبل ازاستفاده آماده شد. تانک الکتروفورز به منبع تغذیه^[۷۵] وصل و ولتاژ آن بر روی ۷۸ تنظیم شد. سپس جهت بررسی نمونه ها، ژل در دستگاه UVP Gel document مدل Bio-Doc(Biometra) گذاشته و با دستگاه White/Ultra Violet Transillumnator ساخت کشور آلمان عکس برداری صورت گرفت.
۳-۴-۴-۱– مواد لازم جهت تهیه بافر TBE
۸/۱۰ گرم Tris-base
۸۱/۰ گرم EDTA
۵/۵ گرم boric acid
مواد فوق در ۸۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر حل و سپس حجم آن به ۱۰۰۰ میلی‌لیتر رسانده شد.
۳-۴-۴-۲- آماده سازی نشانگر مولکولی
یک میکرو لیتر از نشانگر مولکولی با یک میکرولیتر محلول dye 6x loadingو ۴ میکرولیتر آب دیونیزه استریل کاملا مخلوط شدند.
۳-۵- همسانه سازی و تعیین توالی قطعات مختلف ژنوم جدایه ایرانی ویروس بیبذری گوجه فرنگی مجزا شده از گیاه اطلسی (Ker.Mah.P) و ژن پروتئین پوششی جدایه مجزا شده از گیاه داوودی (Ker.Ker.Ch.1)
همسانه سازی با بهره گرفتن از کیت (Fermentas, Lithuania)Ins T/A Clone ™ PCR Product Cloning Kit به شرح زیرانجام شد:
۱- قرار دادن قطعه DNA درون ناقل^[۷۶]
۲- انتقال پلاسمید نوترکیب به درون باکتری^[۷۷]Escherichia coli
۳- انتخاب پرگنه های حاوی پلاسمید نوترکیب
۴- هضم آنزیمی پلاسمید^[۷۸]
۳-۵-۱- قراردادن قطعه DNA موردنظر درون ناقل (Ligation)
به منظور قرار دادن قطعه DNA در درون ناقل، مواد موجود در جدول ۳-۱۰ با هم مخلوط و به مدت ۱ ساعت در دمای ۲۲ درجه سانتی گراد نگهداری شدند. پس از آن محصول حاصل در طولانی مدت در دمای ۲۰- درجه سانتی گراد نگهداری گردید.
بعضی مواقع قبل از انجام عملLigation، نیاز به خالصسازی محصول PCR می باشد که به ۲ روش امکان پذیر میباشد:
۳-۵-۱-۱- خالص سازی محصول پی.سی.آر با بهره گرفتن از کیت (High Pure PCR Product Purification Kit) ساخت شرکت Roche آلمان (Cat No: 11732676001)
۱- در ابتدا حجم اولیهی محصول پیسیآر به ۱۰۰ میکرولیتر رسانده شد.
۲- سپس ۵۰۰ میکرولیتر Binding buffer به آن اضافه، کاملا مخلوط و بوسیله پیپت به درون ستون فیلتر دار انتقال داده شد.
۳- مخلوط فوق به مدت یک دقیقه در بالاترین دور سانتریفیوژ شد. پس از آن مایع جمع شده در زیر فیلتر حذف گردید.
۴- در این مرحله ۵۰۰ میکرولیتر Washing bufferبه ستون فیلتردار اضافه و در ۱۴۰۰۰ دور به مدت یک دقیقه سانتریفیوژ گردید. پس از آن مایع جمع شده در زیر فیلتر حذف گردید.
۵- مجدد ۲۰۰ میکرولیتر Washing buffer به ستون فیلتردار اضافه و در ۱۴۰۰۰ دور به مدت یک دقیقه سانتریفیوژ شد. پس از آن مایع جمع شده در زیر فیلتر حذف گردید.
۶- به منظور حذف کامل بافر شستشو، مجددا ستون فیلتر دار خالی و در حداکثر دور به مدت یک دقیقه سانتریفیوژ گردید.
۷- – ستون فیلتر دار به تیوب ۵/۱ میلی لیتری جدید منتقل گردید.
۸- در آخرین مرحله ۱۰۰ میکرولیتر از Elution bufferبا دقت بر روی فیلتر اضافه و به مدت یک دقیقه در ۱۴۰۰۰ سانتریفیوژ شد.
۳-۵-۱-۲- استخراج از ژل با بهره گرفتن از کیت Agarose Gel DNA Extraction Kit (Roche, Germany) :
۱- در ابتدا باند مورد نظر در زیر نور ماورا بنفش و با یک اسکارپل استریل بریده و به داخل یک تیوب ۵/۱ میلیلیتری که از قبل وزن شده منتقل گردید.
۲- جهت تعیین وزن ژل، تیوب مجددا وزن گردید. در این مرحله به ازای هر ۱۰۰ میلیگرم ژل آگارز، ۳۰۰ میکرولیتر Solubilisation buffer به تیوب اضافه شد.
۳- ۱۰ میکرولیتر Silica suspension به نمونه اضافه گردید. در این حالت قبل از اضافه نمودن بافر، تا بدست آمدن یک سوسپانسیون یکنواخت کاملا بهم زده شد.
۴- مخلوط حاصل به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۶۰ درجهسانتیگراد نگهداری و جهت کمک به حل شدن ژل هر ۲ تا ۳ دقیقه یکبار ورتکس گردید.
۵- تیوب در بالاترین دور به مدت ۳۰ ثانیه سانتریفیوژ و سپس مایع رویی حذف گردید.
۶- در این مرحله ۵۰۰ میکرولیتر از بافر Binding buffer اضافه و با ورتکس کردن به خوبی مخلوط شد.
۷- مرحلهی ۵ تکرار شد.
۸- رسوب حاصل با ۵۰۰ میکرولیتر Washing buffer مورد شستشو قرار گرفت و مجددا در بالاترین دور به مدت ۳۰ ثانیه سانتریفیوژ و مایع رویی حذف گردید.
۹- مرحله قبل مجددا تکرار شد.
۱۰- با کمک پی پت تمامی فاز مایع حذف و جهت خشک نمودن رسوب، تیوب به مدت ۱۵ دقیقه بصورت وارونه بر روی یک دستمال کاغذی استریل، در دمای اتاق قرار داده شد. رسوب حاصل پس از خشک شدن به رنگ سفید روشن درآمد.
۱۱-جهت رقیق نمودن دی.ان.ای ۲۰ تا ۵۰ میکرولیتر از بافر TE buffer اضافه و مخلوط حاصل برای مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۶۰ درجهسانتیگراد قرار داده شد. پس از آن هر ۲ تا ۳ دقیقه یک مرتبه ورتکس گردید.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۱۲- سپس در بالاترین دور به مدت ۳۰ ثانیه سانتریفیوژ و پس از اتمام سانتریفیوژ به دقت و با کمک پیپت، محلول محتوی دی.ان.ای به یک تیوب استریل جدید انتقال داده شد.
۳-۵-۲- مراحل آماده سازی باکتری جهت عمل ترنسفورماسیون (Transformation)
۳-۵-۲-۱- کشت باکتری Escherichia coli بر روی محیط کشت جامد
(Luria Bertani) LB
به منظور بازیابی قدرت تکثیر و رشد باکتری و همچنین افزایش بازدهی عمل transformation، نژاد JM107 باکتری E. coli روی محیط کشت جامد و فاقد آنتی بیوتیک LB کشت گردید. برای تهیه محیط کشت مقدار ۷۵/۰ گرم آگار باکتریولوژی( برای کشت باکتری) و ۱ گرم از محیط LB در ۵۰ میلی لیتر آب دیونیزه اضافه و در دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد به مدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو گردید (جدول ۳-۱۱). این عمل در زیر هود لامینار که قبلا لامپUV به مدت ۱۵ دقیقه روشن شده بود، صورت گرفت. محیط کشت تهیه شده به داخل پتری های پلاستیکی اضافه و بعد از سرد شدن محیط کشت با بهره گرفتن از لوپ، باکتری از محیط کشت اصلی با روش پنج ضلعی یا زیگزاکی بر روی محیط کشت های جدید منتقل گردید. پس از آن پلیت های کشت داده شده به مدت یک شب در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد در داخل انکوباتور قرار داده شدند.
۳-۵-۲-۲-کشت باکتری E.coli در محیط مایع C-medium
جهت کشت باکتری ابتدا مقادیر ۸/۱ و ۲ میلی لیتر از محیط C-medium (که به صورت آماده در کیت Ins PCR Product Cloning Kit TIA Clone TM متعلق به کمپانی Fermentas وجود دارد) در شرایط کاملا استریل درون لوله های شیشه ای ۵۰ میلی لیتری اضافه و اتوکلاو گردید. سپس با بهره گرفتن از لوپ استریل پرگنه های باکتری JM107 از روی محیط کشت جامدLB برداشته و در لوله حاوی ۲ میلی لیتر محیط C-medium تلقیح گردید. پس از آن هر دو لوله که تنها یکی از آن هاتلقیح شده است، به مدت یک شب (۱۶ تا ۲۰ ساعت) در دستگاه شیکر انکوباتور با دمای ˚C37 و۱۳۰ دور در دقیقه قرار داده شدند.
۳-۵-۲-۳- تهیه سلول های مستعد^[۷۹] باکتری E.coli
۱- به منظور تهیه سلول های مستعد، روز بعد ۲۰۰ میکرولیتر از محیط کشت C-medium حاوی باکتری برداشته و به لوله حاوی ۸/۱میلی لیتر از محیط کشت C-medium اضافه می نمائیم (در زیر هود لامینار و در شرایط کاملا استریل). پس از آن لوله مذکور حدود ۲۰ دقیقه بر روی دستگاه شیکر انکوباتور در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد و سرعت ۱۴۰ دور قرار گرفت.
۲- باکتری تلقیح شده را در درون یک تیوب ۵/۱ میلی لیتری استریل اضافه و سپس به مدت ۲۰ ثانیه در ۱۴۰۰۰ دور سانتریفیوژ و فاز رویی آن دور ریخته شد. پس از آن پلیت حاصله حاوی باکتری نگهداری و تیوب به صورت وارونه به مدت ۱۰ ثانیه بر روی دستمال کاغذی به منظور خارج نمودن محیط کشت قرار داده و خشک گردید.
۳- مقادیر مساوی از محلولهای A و B T = (A+B) = (محلول T)] که در کیت مورد استفاده به صورت آماده وجود دارد به یک تیوب ۵/۱ میلی لیتری استریل اضافه گردید. محلول فوق بعد از مخلوط شدن بر روی یخ نگهداری گردید.
۴- مقدار ۳۰۰ میکرولیتر از محلول T به پلیت باکتری اضافه گردید. به منظور مخلوط کردن آن ورتکس (به آرامی، و در حدود چند ثانیه) انجام شد. باکتری حاوی محلول T به مدت ۵ دقیقه بر روی یخ گذاشته و سپس به مدت ۲۰ ثانیه در ۱۴۰۰۰ دور سانتریفیوژ انجام گردید.
۵- در این مرحله ۱۲۰ میکرولیتر( میزان باقی مانده از مخلوط A و B) از محلول A و Bبه باکتری اضافه و به آرامی ورتکس گردید، تا باکتری به خوبی حل گردد. سپس مخلوط حاصله ۵ دقیقه بر روی یخ نگهداری شد.
۳-۵-۳- انتقال پلاسمید نوترکیب به درون باکتری E.coli (Transformation)
۵ میکرولیتر از محلول Ligationبه داخل تیوب های ۵/۰ میلی لیتری (در مرحله قبل)،که بر روی یخ نگهداری شده اند اضافه نموده و سپس۳۰ میکرولیتر از محلول T به هر یک از تیوب ها اضافه گردید. سپس محلول با دست به آرامی به هم زده شد. مخلوط حاصل ۵ دقیقه بر روی یخ نگهداری شد و پس از آن در زیر هود (که با UV به مدت ۱۵ دقیقه وبا پنبه الکلی استریل شد) و مجاور چراغ الکلی با بهره گرفتن از سمپلر بر روی محیط کشت جامد حاوی آمپی سیلین، IPTG وX-gal اضافه گردیده شد (پتری های حاوی محیط کشت از قبل به مدت ۱۰-۱۵ دقیقه در۵/۲۲ درجه سانتی گراد به صورت وارونه قرار ذاذه شد تا سطح محیط خشک شود) آنگاه توسط میله شیشه ای استریل محلول فوق را در تمام سطح پتری پخش نموده و پتری های حاوی محیط کشت بصورت وارونه بمدت یک شب در انکوباتور در دمای °C37 قرار داده شدند.
۳-۵-۴- محیط کشت جامد حاوی آمپی سیلین، IPTG و X-gal